Принцип работы дифференциально диагностических сред. Виды питательных сред. Для фаготипирования бактерии используют фаги

Оглавление темы "Методы выделения бактерий. Микроскопия. Питательные среды для культивирования бактерий.":

Дифференциально-диагностические питательные среды для культивирования бактерий. Среды содержащие белки. Среды содержащие углеводы. Среды для определения редуцирующей способности бактерий.

Дифференциально-диагностические среды (например, среды Хисса, Кларка ) применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена , дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразоваиия, среды для определения протеолитической активности и комбинированные (политропные) среды. В такие среды также часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андраде, бромкрезоловый пурпурный и крезоловый красный), помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андраде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании реактив Андраде и индикатор бром-тимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разделяют на четыре основные группы.

Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты . Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда Минкевича ) и среды Хисса . Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).

Среды для определения редуцирующей способности . В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный, индигокармйн), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).

Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий . Наиболее известны нитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера .

С какой целью используются дифференциально-диагностические среды? Примеры и принципы их работы

Дифференциально-диагностические среды -- специальные смеси питательных веществ, применяемые для определения видовой принадлежности микробов и изучения их свойств. При росте бактерий на дифференциально-диагностических средах протекают химические процессы, обусловленные наличием у микробной клетки различных ферментов. Одни из них способны расщеплять белки, другие --углеводы, третьи -- вызывать реакции окисления и восстановления и т. д. Благодаря действию ферментов в дифференциально-диагностической среде происходят соответствующие изменения. Дифференциально-диагностические среды можно разделить на четыре основные группы.

• 1. Среды, содержащие белок и выявляющие способность микробов расщеплять белки (протеолитические Свойства): мясо-пептонная желатина «столбиком», свернутая лошадиная или бычья сыворотка, молоко, кровяной агар. При посеве бактерий проколом в мясо-пептоннуюжелатину, «столбиком» в случае расщепления белка наблюдают разжижение среды. При посеве на среду со свернутой сывороткой расщепление белка определяют по разжижению среды и образованию углублений на ее поверхности. Расщепление микробом молока выявляется просветлением или растворением первоначально свернувшегося молока. Наличие гемолитической активности исследуемой культуры проверяют посевом ее в чашку Петри на специальный кровяной агар. В результате разрушения эритроцитов вокруг колоний (например, гемолитического стрептококка или стафилококка) образуются зоны просветления.
• 2. Среды для выявления способности микробов расщеплять углеводы и высокоатомные спирты (Эндо среда, Левина среда, Расселла среда, Дригальского -- Конради среда, Рапопорт -- Вайнтрауба среда, Шустовой среда). Для выявления этих свойств микроорганизмов применяют также «пестрый» ряд, т. е. серию пробирок, содержащих питательные среды, включающие различные углеводы, многоатомные спирты и индикатор. В качестве индикаторов пользуются лакмусовой настойкой или бромтимоловым синим. Разложение какого-либо из углеводов с образованием кислоты выявляют по изменению цвета индикатора, образование газа-- по заполнению газом и всплыванию специального стеклянного поплавка в жидкой среде. Или применяют полужидкие Гисса среды (см.) с 0,5% агара с соответствующими сахарами и индикатором Андраде. После посева микроба на эти среды образование кислоты выявляют покраснением среды, а образование газа -- по появлению его пузырьков в агаре или по разрыву и сдвигу вверх агарового столбика. К дифференциально-диагностическим средам второй группы относят также крахмальный агар, служащий для определения способности микробов расщеплять крахмал, среду Кларка и др.
• 3. Среды, на которых выявляется способность микробов обесцвечивать красители, добавленные к бульону: метиленовый синий, тионин, лакмус, индигокармин, нейтральный красный или другие (среда Ротбергера, среда Омелянского). К третьей группе относят также среды с нитратами, служащие для определения способности микробов восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) и далее в аммиак или свободный азот.
• 4. Среды, выявляющие способность микробов усваивать вещества, которые не усваиваются другими микробами, например среда с лимоннокислым натрием (цитратный агар Симонса) для отличия кишечной палочки, которая лишена способности ассимилировать эту среду, от других бактерий кишечной группы или среда с олеиновокислым натрием для дифференциации дифтерийной палочки от ложно дифтерийной и дифтероидов (агарЭнжеринга).

К дифференциально-диагностическим средам относят также среды для дифференциации анаэробов, теллуритовые среды для дифференциации дифтерийных бактерий, среды с мочевиной, щелочные среды (Дьедоннеагар) для культивирования холерного вибриона и др.

Питательные среды - биологические препараты, используемые для выращивания микроорганизмов и изучения культуральных, биохимических, антигенных свойств, фаголизабельности и чувствительности к антибиотикам.

Питательные среды широко используют в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также для контроля за стерильностью лекарственных средств. Для того чтобы микроорганизмы росли и развивались, питательные среды должны отвечать следующим требованиям.

1. Оптимальный состав. В их состав должны входить все необходимые компоненты, которые нужны для развития микробов: белки, витамины, углеводы, минеральные вещества.

2. Оптимальное значение pH. Большинство микроорганизмов развивается при pH 7,2…7,4.

3. Стерильность. Она необходима для того, чтобы избегать конкурентной борьбы между микробами.

4. Прозрачность. Для лучшего изучения характера микробных колоний.

5. Влажность. Питание и дыхание осуществляются путем осмоса и диффузии, поэтому питательные среды должны быть слегка влажными.

Классификация сред . Питательные среды подразделяют по следующим признакам.

1. По консистенции: а) плотные (твердые) - агара 1,2…2 % (мясопептонный агар); б) полужидкие - агара 0,2…0,3 % (полужидкий агар); в) жидкие - мясопептонный бульон.

Для придания средам плотной или полужидкой консистенции чаще всего используют агар-агар - полисахарид, выделяемый из морских водорослей. Агар способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80…100 °С и затвердевающий при 37…40 °С. Устойчивость агара к разжижающему действию большинства микроорганизмов, а также способность образовывать прочные студни обусловили его широкое применение в бактериологии.

2. По происхождению: а) искусственные: животного (МПА, МПБ) и растительного происхождения (пивное сусло); б) естественные: животного (кровь, молоко) и растительного происхождения (кусочки картофеля).

3. По составу: а) белковые; б) безбелковые; в) минеральные.

4. По назначению: а) среды для культивирования (простые, специальные); б) среды для обогащения (для накопления микроорганизмов при их низкой концентрации в исходном материале); в) среды консервирующие для первичного посева и транспортировки патогенов; г) среды для идентификации (дифференциально-диагностические) - микробы одного вида образуют колонии, отличающиеся по внешнему виду от колоний других микроорганизмов.

Если материал слабо загрязнен посторонней микрофлорой, то для выделения культур применяют простые среды общего назначения (МПА), при обильной контаминации сапрофитами используют специальные среды: элективные (для отдельных видов) и дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации).

Характеристики сред . Консервирующие транспортные среды (глицериновая смесь, фосфатный буфер, тиогликолевая среда для анаэробов и др.). Предупреждают отмирание патогенных микробов и подавляют рост сапрофитов.

Среды обогащения (селективный бульон, желчный бульон, среда Мюллера, Раппопорт, среда Кауфмана, щелочная пептонная вода). Применяют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто используют различные красители и химические вещества - соли, желчные кислоты, теллурит калия, антибиотики, фуксин и т. д.

Элективные (селективные среды) . Обеспечивают более благоприятные условия для изолируемого микроба с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры. Например, среды Плоскирева и солевой агар применяют для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры.

Дифференциально-диагностические среды . Предназначены для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.

Среды для выявления протеолитической, гемолитической способности микробов . Содержат в своем составе белковые вещества (кровь, молоко, желатин и др.).

Среды с индифферентными химическими веществами . Служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами (цитратный агар Симмонса).

Среды с углеводами (моносахариды, дисахариды, полисахариды), многоатомными спиртами (сорбит, маннит), гликозидами (салицин, инозит) для обнаружения соответствующих ферментов.

Среды для определения редуцирующей способности микробов . В своем составе содержат краски, обесцвечивающиеся при восстановлении (агар Омелянского с индигокармином), а также нитраты для определения денитрифицирующей способности микроорганизмов.

Сухие питательные среды . В бактериологических лабораториях используют в основном коммерческие сухие среды. Они представляют собой высушенные и измельченные до порошкообразного состояния готовые питательные среды. У сухих сред имеется ряд преимуществ перед средами обычного изготовления: их можно хранить длительно в сухом затемненном помещении в герметически закрытой таре, они транспортабельны, удобны в применении и стандартны, что облегчает получение сравнимых результатов при бактериологическом исследовании.

Плотные среды состоят из питательной основы, агар-агара, индикаторов и других органических и минеральных веществ, улучшающих рост одних и задерживающих рост других микроорганизмов.

В качестве питательной основы сухих сред используют различные источники белка. За рубежом сухие среды чаще всего изготавливают на мясопептонном бульоне, требующем большого расхода говяжьего мяса. В нашей стране в качестве источника белка используют гидролизаты кильки, казеина, кормовых дрожжей.

Для упаковки сухих питательных сред используют стеклянные банки из оранжевого стекла (250 г), полиэтиленовые банки (250, 500, 1000 г), а также пакеты из трехслойной ламинированной бумаги (50…200 г). Сроки хранения в стеклянных и полиэтиленовых банках составляют 2…4 года, а в пакетах из трехслойного ламината - от 1 года до 4 лет.

Отечественная промышленность выпускает более 120 наименований различных сухих питательных сред. Крупнейшими производителями являются ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ГНЦПМ (г. Оболенск) (Меджидов М. М. Справочник по микробиологическим питательным средам. - М.: Медицина, 2003). Наиболее часто применяют в практических лабораториях следующие среды.

Сухие дифференциально-диагностические среды . Если раньше в практике ветеринарных бактериологических лабораторий для идентификации микроорганизмов широко использовались среды Гисса, содержащие какой-либо одни углевод, то в последнее время все шире стали применяться среды, позволяющие дифференцировать микроорганизмы по двум-трем признакам.

Среда Росселя (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет зеленый цвет. После посева культуры через 18…20 ч инкубации при 37 °С о ферментации лактозы судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы - по желтой окраске столбика агара. О газообразовании заключают по появлению пузырьков, разрывам агара. Если микроорганизм не ферментирует глюкозу и лактозу, то среда остается зеленой или приобретает синий цвет.

Среда Клиглера (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала и АООТ «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет красный цвет. Скашивать необходимо так, чтобы остался столбик высотой 2.5…3 см. Посев производят сначала в толщу среды, а затем по скошенной поверхности. Через 18…20 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты. Если микроорганизм ферментирует лактозу, то скошенная часть агара приобретает желтый цвет. При сбраживании глюкозы среда желтеет в столбике. При газообразовании - появление пузырьков и разрывы агара. В случае образования сероводорода среда приобретает черный цвет. Продуцирование индола определяют при помощи специальных индикаторных бумажек.

Двухслойный железоглюкозолактозный агар с мочевиной . Среда Олькеницкого (ФГУП НПО «Питательные среды»). Эти среды позволяют идентифицировать бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу, образовывать сероводород и расщеплять мочевину. С подробной инструкцией о приготовлении, способе посева микроорганизмов и учете результатов можно ознакомиться в «Справочнике по микробиологическим питательным средам» М. М. Меджидова.

Сухие элективные питательные среды . Элективный солевой агар (СА) (ФГУП НПО «Питательные среды» и ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь). Предназначен для выделения стафилококков из исследуемого материала. Может служить основой для приготовления желточно-солевого или молочно-солевого агара. При посеве материала на СА через 48 ч инкубации при 37 °С рост стафилококков в виде круглых колоний диаметром 2…4 мм.

Элективно-питательная среда для выделения пневмококка (пневмококк-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для элективного выделения пневмококка из патологического материала (крови, мокроты, гноя). Готовая среда имеет коричневый цвет. Через 24…48 ч после посева материала и инкубации его при 36…38 °С в условиях «свечного сосуда» пневмококк образует на среде выпуклые колонии размером до 1 мм, хорошо отличимые от бледно-розовых колоний стафилококка.

Питательная среда для изоляции грибов рода Candida (кандида-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала). Предназначена для выделения грибов рода Candida из инфицированного материала и объектов внешней среды. Среда не подлежит автоклавированию. Грибы рода Candida на этой среде через 22…24 ч инкубации при 37 °С образуют плотные выпуклые или плоские колонии сметанообразной консистенции с ровными или волнистыми краями размером 1…2 мм.

Среда подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры (кишечной палочки, протея, стафилококка).

Селективный агар для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий в моче (аналог агара Мак-Конки) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Рекомендуется для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий из мочи, а также может быть использован при бактериологическом исследовании пищевых продуктов, фекалий, сточных вод.

Готовая среда красно-коричневого цвета, прозрачная, с легкой опалесценцией. Через 16…20 ч инкубации посева при 37 °С лактозоотрицательные сальмонеллы образуют прозрачные бесцветные колонии, лактозоположительные эшерихии - колонии ярко-малинового цвета. Среда подавляет «роение» протеев, которые растут в виде бесцветных изолированных колоний в О-форме. Рост стафилококков полностью подавляется.

Питательные среды других групп . Гликолевая среда (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала; ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для контроля стерильности медицинских и биологических препаратов. Учет результатов проводят согласно инструкции «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту».

Питательные среды № 1 и 2 выпускают ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).

Питательная среда для контроля микробной загрязненности сухая № 1 . Используют для определения общей обсемененности нестерильных лекарственных препаратов и пищевых продуктов.

Питательная среда для контроля микробной загрязненности (Сабуро-агар) № 2 . Рекомендуется для культивирования грибов, а также определения содержания грибов в нестерильных лекарственных средах и других объектах внешней среды.

Эритрит-агар и эритрит-бульон . Предназначен для выделения и культивирования бруцелл.

Питательная среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба .

Кетоглутаровый агар . Эффективен для изоляции и культивирования возбудителя туляремии.

Среда АГВ . Предложена для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам дискодиффузным методом.

Питательная среда для экспресс-определения антибиотикочувствительности условно-патогенных бактерий . Предложена для ускоренного определения антибиотикочувствительности грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов. Учет результатов можно проводить через 4…5 ч.

Ассортимент выпускаемых отечественной промышленностью сухих питательных сред постоянно расширяется. Приведено лишь небольшое количество тех, которые могут быть использованы в повседневной работе ветеринарных лабораторий. Кроме того, в настоящее время имеется возможность приобретать и импортные питательные среды. Коммерческие названия можно узнать, заказав соответствующие каталоги. Однако их внедрение и широкое использование в ветеринарных лабораториях РФ возможно лишь в отдаленной перспективе из-за довольно высокой стоимости. Кроме того, в этой главе не упомянуты готовые коммерческие питательные среды довольно хорошего качества производства НИЦФ (г. Санкт-Петербург). Они расфасованы во флаконы по 400 мл; срок хранения 1 год. Среды, безусловно, могут быть полезны при проведении бактериологических работ в полевых условиях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО 2 , СН 4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными - с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.

Сухие среды. Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.

Среда Штерна. Используют для дифференциации сальмонелл. К 1000 см 3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 2,5 см 3 10%-ного насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 16,6 см 3 10%-ного водного раствора натрия сульфита (Na 2 S0 4) и 10 см 3 глицерина. Разлива­ют по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 112° С. Готовая среда имеет желтую окраску. Если испытуемая культура относится к S. typhimurium, которая способна ферментировать глицерин, то среда приобретает фиоле­товый оттенок.

Среда Биттера. Используют для дифференциации сальмонелл. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 0,05 г пептона, 0,5 г на­трия цитрата, 5 г натрия хлорида, 5 г рамнозы (или арабинозы). Кипятят на водяной бане 3-5 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С или текучим паром 3 дня под­ряд по 30 мин. Если испытуемая культура относится к сальмонеллам, спо­собным ферментировать рамнозу или арабинозу (S. typhimurium), то при добавлении к суточной культуре (выращенной на данной среде) 2 капель 0,5%-ного спиртового раствора метилового красного среда приобретает красную окраску.

Среда для посева по Свену -Гарду. Используют для выявления у саль­монелл специфической фазы жгутикового антигена. К 1000 см 3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 8 г агара и раство­ряют путем кипячения на водяной бане. Устанавливают рН 7,2-7,4, филь­труют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 121° С.

Среды с аминокислотами. Используют для определения способности энтеробактерий в анаэробных условиях расщеплять левовращающие ами­нокислоты - лизин, орнитин, аргинин. В 600 см 3 дистиллированной воды растворяют 5 г пептона и 1 г глюкозы, устанавливают рН 6,0-6,1. Приготовленный раствор разливают по 150 см 3 в четыре колбы. В каждую из трех колб вносят по 10 г одной из аминокислот. Четвертая колба остается в качестве контрольной. Содержимое всех колб кипятят на водяной бане 5-10 мин, устанавливают рН 6,0-6,1. Во все че тыре колбы вносят по 0,6 см 3 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезоло-вого пурпурного или бромтимолового синего и по 5 см 3 0,1%-ного спиртово­го раствора крезолового красного. Разливают в агглютинационные пробир­ки по 2-3 см 3 и стерилизуют 30 мин при 110° С.

Для проведения теста в пробирки, содержащие аминокислоту, и в конт­рольную пробирку засевают испытуемую культуру, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом (слоем толщиной 10 мм) и инкубируют. Учет проводят в течение 4 сут. При положительной реакции среды с амино­кислотами приобретают фиолетовую или синюю (в зависимости от индика­тора) окраску, в контрольных пробирках среда имеет желтую окраску.

Состав 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезолового пурпурного: бромкрезоловый пурпурный - 1,6 г, спирт этиловый 96° - 100 см 3 .

Состав 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного: крезоловый красный - 0,1 г, спирт этиловый 96° - 100 см 3 .

Среды, содержащие органические кислоты. Используют для дифферен­циации сальмонелл по их способности расщеплять органические кислоты (тартраты, мукаты, натрия цитрат). В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, добавля­ют 8,5 см 3 0,1 Н раствора натрия гидроокиси, 12 см 3 0,25%-ного водного ра­створа бромтимолового синего, 10 г D-тартрата (или одну из следующих кислот: 5 г L-тартрата, 5 г мезотартрата, 10 г муката, 10 г натрия цитра­та). Устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки и стерилизуют 20 мин при 112° С. Готовая среда синезеленого цвета. При положительной реакции в процессе инкубации среда с культурой приобретает зелено-желтую окраску.

Для получения более четких результатов в конце срока инкубации в пробирки с сомнительной или отрицательной реакцией добавляют несколь­ко капель насыщенного раствора ацетата свинца, в результате при отрица­тельной реакции выпадает обильный осадок (до 2 / 3 объема среды), при по­ложительной - выпавший осадок незначителен.

Среда с триптофаном. Используют для определения у бактерий нали­чия триптофандезаминазы. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г DL-триптофана. Устанавливают рН 6,7-6,9. Для определения способности бактерий к дезаминированию триптофана испытуемую агаровую культуру бакте­риологической петлей вносят в пробирку с 0,5 см 3 раствора триптофана и инкубируют 30 мин при 37° С, после чего вносят
1 каплю 10%-ного водного раствора железа хлористого трехвалентного (FeCl 3). При поло­жительной реакции среда приобретает темно-красную окраску, при от­рицательной - желтую.

Среда с калием цианидом. В 1000 см 3 дистиллированной воды раство­ряют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,225 г калия дигидрофосфата (КН 2 Р0 4), 5,64 г натрия гидрофосфата (Na,HP0 4). Устанавливают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 112° С. Пос­ле стерилизации быстро охлаждают. Среду этого состава используют в качестве контрольной. Непосредственно перед применением к 100 см 3 сре­ды асептически добавляют 1,5 см 3 свежеприготовленного 0,5%-ного вод­ного раствора калия цианида (KCN), разливают по пробиркам и закры­вают корковыми пробками.

Пробу считают положительной, если через 24-48 ч после посева куль­туры в среде заметно помутнение или опалесценция. При отрицательном результате среда остается абсолютно прозрачной, в то время как в конт­рольной пробирке заметно помутнение.

Среда Клиглер. Используют для определения образования сероводорода. В 1000 см 3 МПБ растворяют при кипячении 20 г пептона, 5 г натрия хло­рида, 0,4 г натрия сульфида, 0,08 г натрия тиосульфата, 20 г агара. Устанав­ливают рН 7,8, затем снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 0,5 г железа сернокислого, растворенного в небольшом количе­стве воды, 10 г лактозы, 1 г глюкозы и 12 см 3 0,2%-ного раствора фенолрота в 50%-ном спирте. Среду разливают по 6-7 см 3 в пробирки и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среда имеет оранжево-красную окраску. При образовании сероводорода среда окрашивается в черный цвет.

Среда Кларка. Используется для постановки реакции Фогес-Проскауэра и пробы с метиловым красным для определения окисления глюкозы с образованием 2-кетоглюконата. В 100 см 3 дистиллированной воды растворяют 0,5 г калия гидрофосфа­та (К 2 НР0 4), 0,7 г пептона, 0,5 г глюкозы. Кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при
111° С.

Реакцией Фогес-Проскауэра выявляют промежуточный продукт рас­щепления глюкозы - ацетилметилкарбинол (ацетоин). Для этого испытуе­мую культуру выращивают на среде Кларка 4-5 дней в 2 пробирках. Одну пробирку культивируют при 25° С, другую при 37° С. Из обеих пробирок по 1 см 3 культуры переносят в другие пробирки и добавляют 0,6 см 3 5%-ного спиртового раствора а-нафтола, смесь перемешивают. Затем добав­ляют 0,2 см 3 .40%-ного водного раствора КОН. Тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч.

Учет реакции проводят через 15 и 60 мин. Положительная реакция - вишневое окрашивание среды.

Тестом с метиловым красным устанавливают снижение рН среды при расщеплении глюкозы до 4,4-6,0. Раствор метилового красного готовят добавлением к 0,1 г метилрота 300 см 3 95%-ного этанола. После растворения красителя добавляют 200 см 3 дистиллированной воды.

Для постановки теста в пробирку с 5 см 3 среды Кларка вносят петлю испытуемой культуры и инкубируют 2-5 сут при 25° С. Затем добавляют 5-6 капель реактива метиловый красный и следят за изменением окраски. При положительном результате (рН 4,0-6,0) среда приобретает красный цвет. При отрицательном результате (рН 6,0-7,0) среда приобретает жел­тый цвет.

Среда с мочевиной по Кристенсену. Используют для определения спо­собности бактерий к гидролизу мочевины (уреазная активность) с образо­ванием аммиака и углекислоты. В 1000 см 3 дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2 г калия дигидрофосфата (КН 2 Р0 4), 20 г агара. Смесь стерилизу­ют 20 мин при 115° С. Затем вносят 1 г глюкозы и 6 см 3 0,2%-ного раствора фенилрота, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50° С и асептичес­ки добавляют 100 см 3 20%-ного водного раствора мочевины, стерилизован­ного фильтрацией. Среду разливают по пробиркам и скашивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность скошенного агара и культивируют 1-4 сут. Положительный результат (защелачивание сре­ды) - красно-малиновое окрашивание среды.

Среда Симмонса. Используют для определения способности бактерий утилизировать цитрат как единственный источник углерода. Состав: агар - 20 г, NaCl - 5 г, MgS0 4 х 7Н 2 0 - 0,2 г, К 2 НР0 4 - 1 г, NH 4 х Н 2 Р0 4 - 1 г, C 6 H 5 0 ? Na 3 х 5Н 2 0 - 3 г, бромтимоловый синий - 0,08 г, вода дистиллированная - 1000 см 3 .

В дистиллированной воде растворяют агар. Соли растворяют отдельно в небольшом объеме воды и затем смешивают с агаром, до объема 1000 см 3 . Устанавливают рН 7,2, добавляют 40 см 3 0,2%-ного водного раствора бромтимолового синего. Среду перемешивают, разливают в пробирки по 5-7 см 3 и стерилизуют 15 мин при 121° С. После автоклавирования агар ска­шивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность агара и инкубируют. При положительном результате отмечают рост культуры на среде и измене­ние ее цвета с оливкового на синий.

Среда с алгинатом натрия. Используют для определения способности бак­терий утилизировать натрия алгинат как единственный источник углерода. Состав среды аналогичен составу среды Симмонса, но вместо натрия цитрата вносится 2,5 г натрия алгината. Положительным считают изменение цвета среды. Микроорганизмы, не обладающие способностью усваивать натрия алгинат, на данной среде не растут.

Среды Гисса. Используют для изучения способности ферментации угле­водов с образованием кислоты и газов. Состав: пептон - 10 г, натрия хлорид - 5 г, вода дистиллированная - 1000 см 3 , 0,1%-ный индикатор Андреде, углевод 0,5% (адонит, глицерин, сор­бит, дульцит, целлобиоза, раффиноза, трегалоза, салицин, арабиноза, мальто­за, рамноза, ксилоза) или 1,0% (глюкоза, лактоза, маннит, сахароза).

В дистиллированной воде растворяют навески пептона, натрия хлорида, добавляют индикатор, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,1-7,2 и стерилизуют 15 мин при 111 ° С. Затем добавляют углевод. Приготовленную среду разливают по пробиркам и стерилизуют
15 мин при 110° С.

Среда для выявления фенилаланиндезаминазы. Состав: сухой дрожжевой экстракт-3 г, натрий хлористый - 5 г, L-фенилалапин - 1 г, Na 2 HP0 4 - 1 г, агар - 12 г, вода дистиллированная - 1000 см 3 . Смешивают воду и дрожжевой экстракт, нагревают, добавляют компо­ненты и кипятят до расплавления агара, рН среды 7,0-7,2. Горячую среду фильтруют, разливают в пробирки по 2-3 см 3 и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среду скашивают.

Испытуемую культуру засевают штрихом по поверхности агара и через сутки инкубации добавляют на поверхность культуры несколько капель 10%-ного водного раствора железа хлорида (FeCl 3). При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет, при отрицательном результате сохраняется желтое окрашивание.

Среда для выявления β-галактозидазы. В 100 см 3 расплавленного и охлажденного до 40-45° С МПА асепти­чески добавляют 20 см 3 1%-ного водного раствора О-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. Среду разливают по пробиркам.

Испытуемую культуру засевают уколом петлей до дна пробирки. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С.

При положительной реакции среда окрашивается в желтый цвет одним из конечных продуктов гидролиза О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида О-нитрофенолом.

Среды для выявления лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы и чргининдегидролазы. Состав: мясная вода - 400 см 3 , пептон - 5 г, глюкоза - 1 г, вода дистиллированная - 600 см 3 , 0,1%-ный спиртовой раствор крезолового красного - 5 см 3 , 1,6%-ный спиртовой раствор бромкрезолового пурпурного - 0,6 см 3 , L-лизин (или орнитин, или аргинин) -10 г.

Мясную воду, пептон, глюкозу и дистиллированную воду смешивают, устанавливают рН 6,0-6,1. Вносят аминокислоту, кипятят 8-10 мин, до­бавляют индикатор и разливают в агглютинационные пробирки по
3 см 3 . Стерилизуют 30 мин при 110° С. Цвет среды розовый.

Испытуемую культуру засевают в среды с аминокислотами (опыт) и среду безаминокислоты (контроль). Во все пробирки вносят стерильное вазелиновое иасло до получения слоя в 4-5 мм. Пробирки инкубируют 4 дня при 37° С.

При положительной реакции (защелачивание среды) наблюдается синee окрашивание в опытных пробирках и желтое - в контрольной.

Среда для определения пиразинамидазной активности у Y.enterocolitica . Состав: трипсинизированный соевый агар - 30 г, дрожжевой экстракт сухой - 3 г, пиразинкарбоксиамид - 1 г, трисмалат буфер 0,2 М, рН 6,0-1000 см 3 .

Составные части среды смешивают и подогревают на водяной бане до их растворения. Разливают по 5 см 3 в пробирки, стерилизуют 30 мин при 112° С и скашивают.

Среда для определения калъцийзависимости роста у Y. Enterocolitica . В качестве питательной основы используют коммерческую среду для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (агар АГВ).

К стерильному расплавленному и охлажденному до 50° С агару добав­ляют (из расчета на 100 см 3) 8 см 3 0,25 М стерильного натрия щавелевокис­лого, среду тщательно перемешивают и вносят 4 см 3 0,5 М стерильного раствора магния хлорида. Готовую среду разливают по чашкам Петри.

Определение индолообразования. Испытуемую культуру выращивают в пробирке с бульоном Хоттингера. В пробирку с культурой вносят 2-3 капли эфира, тщательно ее встря­хивают, оставляют в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфи­ра. Осторожно добавляют
0,5 см 3 реактива Эрлиха, выдерживают 5 мин и учитывают результат. При наличии индолообразования слой эфира приоб­ретает розово-красный цвет.

Для приготовления реактива Эрлиха в 95 см 3 96%-ного этанола раство­ряют 1 г парадиметиламинобензальдегида и добавляют 20 см 3 концентри­рованной хлористоводородной кислоты (НС1).